|
Vervaardiging van vollengte H5 in E. coli en suiwering deur middel van VPVC
Authors: D. Patini1, N. Da Camara1, G. Koorsen1
Affiliations: 1Department of Biokinetics, University of Johannesburg, South Africa
Correspondence to: D. Patini
Postal address: Private Bag X11, Arcadia 0007, South Africa
How to cite this abstract: Patini, D., Da Camara, N. & Koorsen, G., 2014, ‘Vervaardiging van vollengte H5 in E. coli en suiwering deur middel van VPVC’, Suid-Afrikaanse Tydskrif vir Natuurwetenskap en Tegnologie 33(1), Art. #1227, 1 page.
http://dx.doi.org/10.4102/satnt.v33i1.1227
Note: This paper was initially delivered at the School of Environmental Sciences and Development of the North-West University, Potchefstroom Campus, South Africa on 05 October 2012.
Copyright Notice: © 2014. The Authors. Licensee: AOSIS OpenJournals. This is an Open Access article distributed under the terms of the
Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution,
and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Production of full-length H5 in E. coli and purification by FPLC. It has been suggested that full-length chicken H5 cannot be expressed in E. coli. We expressed codon-optimized H5 in E. coli BL21DE3, obtaining high levels of full-length H5. The protein was purified by (NH4)2SO4 precipitation and two FPLC steps.
Die nukleosoom bestaan uit twee kopieë elk van die kernhistone H2A, H2B, H3 en H4 waarom ongeveer 146 bp DNS gedraai is. Die koppelhistoon H1/5 bind aan die nukleosoom en neutraliseer die negatiewe ladings op DNS wat tussen nukleosome lê. Sodoende kan naasliggende nukleosome teenmekaar pak sodat die ongeveer 2m-lange DNS-stringe in die mensgenoom in ’n selkern met ’n omtrek van 20 µm kan inpas. Rekombinante DNS-tegnologie het die afgelope drie dekades daarvoor gesorg dat biochemiese navorsing met rasse skrede vooruit gegaan het. Heterogene genetiese materiaal kan só in gas-organismes uitgedruk word om proteïene te vorm wat uit die gas-organisme gesuiwer kan word. Hoender-eritrosietchromatien is ’n gewilde modelsisteem om die struktuur en funksie van metasoön-chromatien te bestudeer. In hierdie model word nukleosome hoofsaaklik deur die koppelhistoon H5 gepopuleer. Dit is vroeër beweer dat ’n volledige H5 nie via rekombinante tegnologie in E. coli vervaardig kan word nie, maar slegs fragmente van die proteïen. Daar is aangevoer dat die bRNS vir H5 deur E. coli gevorm kan word, maar dat die translasie-proses in E. coli ontoereikend is om die hele proteïen te vervaardig. ’n Moontlike rede hiervoor is dat die karboksiel-terminale domein van H5 talle lisien- en arginien-kodons bevat wat volop in metasoöns voorkom, maar bykans ontbreek in bakterieë. Die translasie-masjienerie van E. coli word dus heel waarskynlik vinnig versadig tydens vervaardiging van H5, sodat die volle proteïen nie gemaak kan word nie. Ons het dus gehipotetiseer dat ’n sintetiese H5-konstruk waarin elke kodon geoptimaliseer is vir uitdrukking in E. coli en waarbinne die moontlikheid vir sekondêre struktuurvorming van die mRNS geminimaliseer is, deur E. coli uitgedruk behoort te word. ’n Konstruk is ontwerp en bekom vanaf GenScript in die VSA. Die konstruk is deur middel van snyding met die restriksieensieme NdeI en XhoI na ’n pET22 vektor verskuif en geheg. Ná sifting van E. coli klone wat met laasgenoemde DNS getransformeer is, is positiewe klone geïdentifiseer. Die pET22-H5-vektor is uit ’n positiewe kloon geïsoleer en E. coli BL21DE3-selle is hiermee getransformeer. Die uitdrukking van H5 in BL21DE3-selle is vervolgens bestudeer deur die selle in kultuur te kweek onder optimale kondisies, die uitdrukking van H5 aan te skakel deur middel van induksie met isopropielthiogalaktosied (IPTG) en die vorming van proteïene te moniteer deur middel van elektroforese deur ’n poli-akrielamiedjel. Voorts het ons ons voorgeneem om H5 vanuit die E. coli selle te suiwer. Selle is geoes deur middel van sentrifugering en oopgebreek deur hoë-energie sonikasie. H5 is gesuiwer vanuit die E. coli-lisaat deur ’n drie-stap suiweringsregime bestaande uit katioon-uitruilchromatografie, differensiële ammoniumsulfaatneerslag en hidrofobiese interaksie-chromatografie toe te pas (vinnige proteïen vloeistofchromatografie, VPVC, is hiervoor gebruik). Die identiteit van die gesuiwerde H5 is bevestig deur middel van massa-spektrometrie. Ons het bevind dat vol-lengte H5 in groot hoeveelhede deur E. coli vervaardig word deur van bogenoemde metodes gebruik te maak. Om vas te stel of ons metode om vol-lengte H5 te vervaardig en te suiwer uitgebrei kan word tot ander koppelhistone, het ons die uitdrukking en suiwering van H1.11L (’n ander hoender-koppelhistoon) aangepak. Ons het bevind dat ons strategie van sintetiese kodon-optimisering van die H1.11L geen, uitdrukking in E. coli BL21DE3-selle bemiddel deur die pET-sisteem en VPVC-suiwering suksesvol was. Die vervaardiging van vollengte H5 deur middel van rekombinante metodes verbreed die potensiaal van hoendereritrosiet-chromatien as modelsisteem om die struktuur en funksie van chromatien te bestudeer.
|