|
Standardisering van tegnieke vir sellulêre beennavorsing
Authors: A.E. Kasonga1, S. Marais1, J.C.A. Boeyens1, M.C. Kruger2, M. Coetzee1
Affiliations: 1Department of Physiology, University of Pretoria, South Africa; 2Institute for Food, Nutrition and Human Health, Massey University, New Zealand
Correspondence to: A. Kasonga
Postal address: Private Bag X11, Arcadia 0007, South Africa
How to cite this abstract: Kasonga, A.E., Marais, S., Boeyens, J.C.A., Kruger, M.C. & Coetzee, M., 2014, ‘Standardisering van tegnieke vir sellulêre beennavorsing’, Suid-Afrikaanse Tydskrif vir Natuurwetenskap en Tegnologie 33(1), Art. #1215, 1 page.
http://dx.doi.org/10.4102/
satnt.v33i1.1215
Note: This paper was initially delivered at the School of Environmental Sciences and Development of the North-West University, Potchefstroom Campus, South Africa on 05 October 2012.
Copyright Notice: © 2014. The Authors. Licensee: AOSIS OpenJournals. This is an Open Access article distributed under the terms of the
Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution,
and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Standardisation of techniques for bone cellular research. Bone remodelling is a continuous process involving osteoclasts and osteoblasts. Long chain polyunsaturated acids (LCPUFA) are known to assist in bone disorders that disrupt the remodelling process. Methods to study the effects of LCPUFAs on bone cells in vitro have been standardized for future studies.
Hermodellering van been is ‘n deurlopende proses en word bemiddel deur beenresorpsie deur osteoklaste en beenvorming deur osteoblaste. Osteoklaste is meerkernige selle wat ontstaan vanaf hematopoëtiese voorgangers. Hierdie voorgangerselle differensieer na osteoklaste wanneer dit blootgestel word aan reseptor-aktiveerder van nukluêre faktor-kappa B ligand (RANKL) en makrofaagkolonie-stimulerende faktor (M-CSF), wat deur osteoblaste geproduseer word. Studies het getoon dat dieetvetsure, soos langketting poli-onversadigde vetsure (LKPOV) ‘n rol speel in beenregulering. Werk in ons laboratorium het getoon dat LKPOV die vorming en resorberende vermoë van osteoklaste, afkomstig vanaf RAW 264.7 muismakrofae, inhibeer. Hierdie navorsingsprojek fokus tans op die effekte van LKPOV op CD14+ mensmonosiete en die tegnieke om dit te bestudeer word tans gestandaardiseer. RAW 264.7 muismakrofae is teen 2500 tot 10 000 selle per putjie in ’n 96-putplaatjie gesaai en vir twee dae gelaat om te groei, waarna die AlamarBlou-toets daarop uitgevoer is. Hierdie toets is ’n tydbesparende en bekostigbare metode om die hoeveelheid lewende selle in kultuur te kwantifiseer sonder om die selle te beskadig. Die AlamarBlou-toets word gebruik terwyl die selle in kultuur is omdat dit gebaseer is op ’n ensiemreaksie wat tot ’n kleurverandering lei. Nadat hierdie toets uitgevoer is, is dieselfde selle opeenvolgend vir kristalvioletkleuring of tartraatweerstandige-suurfosfatase (TRAP)-aktiwiteitbepaling in osteoklaste gebruik. ’n Kenmerk van volwasse osteoklaste is dat dit die ensiem tartraatweerstandige-suurfosfatase (TRAP) sintetiseer. Hierdie verskynsel word algemeen in navorsing gebruik as bevestiging van osteoklastogenese. Die gebruik van para-nitrofenolfosfaatsubstraat om die TRAP-aktiwiteit in volwasse osteoklaste te bepaal is onlangs in ons laboratorium gestandaardiseer. Hierdie metode neem slegs 1 h in vergelyking met die kommersieel-beskikbare TRAP-toetsstelle en is baie sensitief. ’n Belangrike eienskap van volwasse osteoklaste is dat hulle been resorbeer. Navorsing op bees-beenskyfies is egter baie duur en kultuurplaatjies wat bedek is met ’n sintetiese anorganiese beenoppervlak word dikwels as plaasvervanger vir been gebruik. Die visualisering van resorpsie-put vorming op Corning® OsteoAssay-plaatjies is ’n dus ’n noodsaaklike toets om te bepaal of LKPOV die resorpsievermoë van osteoklaste beïnvloed. As gevolg van swak kontras tussen die resorpsie-oppervlak en die resorpsieputjies, is ’n gemodifiseerde von Kossa-kleuring gebruik om die kontras te verbeter. NIH Image J sagteware is verder gebruik om die kwaliteit te verbeter en foto’s van resorpsieputjies te ontleed. Die resultate toon ʼn verbeterde beeldkwaliteit en ontleding na implementering van hierdie tegnieke. Die navorsingsgroep bestudeer ook die in vitro effekte van LKPOV op osteoklast-osteoblast koëkulture om die interaksies tussen hierdie twee beenselle te ontleed. RAW 264.7 monosiete en MC3T3-E1 pre-osteoblaste is saamgevoeg en ʼn studie is uitgevoer om die konsentrasies van selle en reagense te standaardiseer waarby hierdie twee seltipes saam gekweek kan word. Die tegnieke wat ontwikkel is, sal toegepas word in toekomstige sellulêre beennavorsing in ons laboratorium. Hierdie studie is befonds deur die MNR en NAVKOM (UP).
|